报告人：Haruhiko Bito

整理人：井淼

审核人：李毓龙

2018年4月24日下午,来自日本东京大学(University of Tokyo) 医学院的Haruhiko Bito教授受 IDG/麦戈文脑研究所李毓龙老师的邀请，在北京大学王克桢楼1113会议室为大家分享了其研究组近年来的工作，其报告题目是：Multiplex Imaging of Neural Activity and Signaling Dynamics。Haruhiko Bito教授在美国科学院院士Richard Tsien实验室接受博士后训练，主要贡献为解析神经元中特定蛋白在神经元激活后的磷酸化修饰以及其与基因表达之间的关系。其在东京大学的实验室的研究方向为解析大脑复杂生物学过程背后的神经元信号传递的机理，包括其中重要媒介分子的鉴定及其机理解析，以及开发新的技术手段用于更加精细的控制和追踪神经元的活性及其信号分子的动态变化。本场讲座中，Haruhiko Bito教授主要介绍了两个工作，其一为优化的基因元件用以标记激活的神经元，另一个为多色的新一代基因编码的钙离子探针的开发及其应用。

众所周知，大脑复杂行为的基础为神经元的动态活动及其复杂的相互联系。然而，由于神经系统的复杂性及行为的多样性，参与特定行为的神经元的鉴定以及追踪神经元间的突触联系仍然受限于现有的技术手段。自从最早的立早基因（immediate early gene），即在神经元兴奋后迅速反应并增强表达的基因的发现之后，其响应神经元活性的区域可与报告基因进行融合，从而实现对于特定行为中激活的神经元的标记。进一步的优化基于立早基因的标记系统，如提高及检测灵敏度和信噪比，可提高活性神经元的标记效率，实现对于激活神经元的高效标记，以及对于神经元之间长距离突触联系的灵敏检测。Haruhiko Bito研究组与2008年通过对于立早基因Arc的启动子区域的步进筛选，成功鉴定了其中最关键的响应神经元活性的功能元件，命名为SARE（synaptic activity-response elements)1。当与最小启动子及报告基因串联后，基于SARE元件的方法可成功实现对于激活神经元的标记，并且在未激活的神经元中具有较低的背景。基于该SARE元件，Haruhiko Bito组通过进一步的基因改造手段，将SARE元件进行多次重复，并优化了其中的连接序列。最终，具有五个重复SARE元件的序列，E-SARE，在串联报告基因后表现出最强的报告基因的表达，并且其相比于之前的c-fos和单个SARE介导的报告基因表达强度高出20-30倍以上2（图一）。同时，E-SARE元件的大小仅有975bp，因此其十分适合构建在病毒介导的基因表达载体中，如AAV载体。

图一：E-SARE元件的开发。

大脑中许多核团之间存在长距离的突触联系，如视觉皮层神经元投射到视上丘，脑干处核团如蓝斑等投射到海马、皮层等。传统的基于立早基因的标记兴奋神经元的方法由于神经元活性响应元件的强度较低，其缺乏足够的灵敏性和信噪比，难以积累足够的报告蛋白以实现长距离突触连接的精确标记。为了验证基于E-SARE的方法是否具有足够的灵敏性以标记长距离的突触联系，Haruhiko Bito组将E-SARE-Cre与Cre依赖的loxp-RFP两种病毒共注射到视上丘区域，并在给予视觉刺激之后检测激活的视上丘神经元在视觉皮层V1的长距离投射标记。同时，通过引入一个不依赖Cre表达的含有GFP报告基因的病毒，可实现对于注射区域所有LGN-V1神经投射的绿色荧光标记。在单侧眼睛的视觉刺激后，Haruhiko Bito组观测到在LGN区域的细胞胞体有明显的红色荧光标记，表明LGN神经元胞体受到视觉刺激而兴奋。在刺激眼睛同侧的V1区域中，红色荧光信号相比于绿色荧光信号表现出在外侧V1区域的富集，而在对侧的红色荧光信号表现出均一的分布，表明LGN中收到视觉刺激兴奋的神经元在V1区域呈现出特征性的投射（图二）。这一结果也表现出基于E-SARE的标记技术可实现对于兴奋神经元的长距离突触的灵敏标记。

图二：应用E-SARE原件实现神经元间长距离突触连接的荧光指示。

基于E-SARE的兴奋神经元标记的方法虽然十分强大，然而其本身涉及到报告基因的表达，这个过程需要较长的转录和翻译时间，因此不适合实时追踪神经元的快速活动变化。相对的，基因编码的钙离子探针可实现在特定神经元的表达，并可结合实时成像手段对神经元的钙信号进行记录，以反应神经元的兴奋性。在诺贝尔奖获得者Roger Tsien组于1997年第一次开发出基因编码的钙离子探针3至今，多个实验室致力于优化钙离子探针的信号响应幅度，其中Janelia Research Campus于2013年优化的新一代钙离子探针GCaMP6可实现对于神经元单个动作电位引发的钙信号的灵敏快速检测。然而，其最大的缺陷为荧光变化随钙离子浓度变化的曲线为非线性，无法实现对于神经元活性较为定量的检测。同时，已有的钙离子探针的荧光响应速度仍然较慢，对于多个高频率的连续刺激可能难以准确区分。更重要的是，已有的钙离子探针大多为基于绿色荧光蛋白构建，而具有较优的光学穿透性，适合活体深部脑区成像的红色钙离子探针仍然表现较差4。为了解决该问题，Haruhiko组希望能够开发一系列光谱不重叠的，具有线性荧光响应和快速动力学的新一代钙离子探针。

以往的钙离子探针多数基于钙调蛋白Calmodulin（CaM）构建，而CaM蛋白本身对于钙离子的响应线性程度较差。因此，Haruhiko Bito组挑选了神经元中的钙离子结合蛋白CaMKK作为钙探针的构建骨架。CaMKK蛋白活性与钙离子浓度变化之间呈现出较好的线性关系，并且相比于主要在肌肉中分布的CaM蛋白，神经元CaMKK蛋白在指示神经元中钙离子变化方面具有更加优秀的亲和力和动力学特性，基于其开发的钙离子探针可能会克服以往探针的一系列问题。通过将红色荧光蛋白和CaMKK钙结合骨架蛋白进行融合，并经过一系列的突变筛选和优化，Haruhiko Bito组获得了新一代的红色钙离子探针，命名为RCaMP25。在给予不同数量的电刺激时，RCaMP2的荧光信号与刺激数量之间表现出较好的线性相关性，表明该探针可实现对于神经元活性的定量检测（图三）。同时，对其荧光信号的分析表明RCaMP2探针具有良好的反应动力学，相比于传统的绿色钙指示剂GCaMP6和红色钙指示剂RCaMP1.07都表现出更快速的反应。

图三：新一代红色荧光钙离子探针RCaMP2的开发及其表现。

由于红色钙探针RCaMP2与绿色钙探针GCaMP6的光谱不同，因此两种探针可在同一个实验动物中共同标记和表达，以实现对于不同类型神经元活性的同时追踪。在以往的工作中，多巴胺能神经元已被证明介导奖赏等行为。然而，非多巴胺神经元在该过程中的动态变化如何，以及多巴胺能神经元和非多巴胺能神经元在奖赏行为过程中是否具有功能上的协同性仍然缺乏足够刻画。为了实现这一目的，Haruhiko Bito组通过cre-loxp系统的基因元件，在TH-Cre小鼠的多巴胺能神经元中通过DIO-RCaMP2实现红色钙探针的表达，通过hsyn-DO-GCaMP6m实现在非多巴胺能神经元中绿色钙探针的表达6。在给予奖赏刺激时，RCaMP2标记的神经元表现出明显的红色荧光信号的升高，而在惩罚刺激时表现出荧光信号的降低，表明多巴胺能神经元在奖赏或惩罚行为中的活性受到不同的调节。相对的，GCaMP6m标记的非多巴胺能神经元在奖赏和惩罚刺激中都表现出荧光信号的增强，虽然其信号的时常略有不同（图四），表明非多巴胺能神经元在该行为中表现出与多巴胺能神经元不同的功能响应。

图四：应用光谱不重叠的RCaMP2和GCaMP6m实现在特定行为中不同类型神经元活性的同时检测。

在进一步的工作中，Haruhiko Bito组将红色荧光探针RCaMP2的构建原理拓展到其他颜色的钙离子探针中，期望得到一系列光谱不重叠的，具有良好线性响应和快速反应动力学的钙离子探针。基于CaMKK为骨架，通过一系列的突变筛选，Haruhiko Bito组最近获得了四种不同颜色的钙离子探针XCaMP，分别为蓝色的XCaMP-B，绿色的XCaMP-G，橙色的XCaMP-O和红色的XCaMP-R。结合特定的神经元特异的表达方法，Haruhiko Bito组可在兴奋性神经元和多种不同类型的抑制性神经元，如PV+神经元或SST+神经元中同时表达光谱不重叠的钙离子探针，并实时检测几类神经元对于特定刺激的兴奋性变化以及神经元间的功能连接。Haruhiko教授向我们展示了其通过多种钙离子探针成功指示小鼠桶装皮层中不同神经元的兴奋性变化，并揭示了特定神经元间形成的突触特异的功能性抑制。

讲座最后，Haruhiko Bito教授表示，在未来的研究中其研究组希望能够基于已开发的新技术，包括基于E-SARE实现的兴奋性神经元的标记以及新一代多色钙离子探针的开发，可以对神经系统中特定神经元在行为过程中的活性变化及其信号分子的动态变化进行灵敏的指示。在提问环节中有同学问到新一代的钙离子探针表达在神经元中是否对神经元的活性有较大影响，Haruhiko Bito教授表示在其实验体系中，长时间表达XCaMP并没有对神经元的活性有任何可观测到的影响，表明其仍然可以反映生理情况下神经元的活性变化。另外有老师提问新一代的XCaMP是否可以通过比值测量（ratiometric）的方法实现更加定量的钙离子检测，Haruhiko Bito教授表示在他们的筛选过程中已经发现有候选探针具有两个不同的激发峰，并且表现出钙离子依赖的荧光信号变化，可实现对钙离子的比值测量。对于其他的精彩提问，Haruhiko Bito教授也耐心的一一做出了解答。最终本次学术报告在良好的氛围中圆满结束。

参考文献：

1.      Kawashima, T. et al. Synaptic activity-responsive element in the Arc / Arg3 . 1 promoter essential for synapse-to-nucleus signaling.  (2008).

2.      Kawashima, T. et al. Functional labeling of neurons and their projections using the synthetic activity-dependent promoter E-SARE. Nature Methods 10, 889-895 (2013).

3.      Miyawaki, a. et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature 388, 882-887 (1997).

4.      Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y. & Nakai, J. An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials. PLoS ONE 7 (2012).

5.      Inoue, M. et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nature Methods 12, 64-70 (2014).

6.      Kim, C.K. et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods 13, 325-328 (2016).