报告人：Dr. Bradley Baker

整理人：孙晨曦

审核人：李毓龙

       2017年3月7日下午，来自韩国科学技术研究所(Korea Institude of Science and Technology, KIST)的Dr. Bradley Baker受生命科学强化挑战班的邀请来到北京大学，并在金光生命科学大楼邓祐才报告厅为大家带来了一场报告：Imaging neuronal activity with genetically encoded voltage indicators (GEVIs).  Dr. Baker的主要研究方向是基因编码的神经细胞膜电位探针的开发和对神经网络进行成像。本次讲座中，Baker教授介绍了GEVI的相关知识和目前的研究进展，以及在优化GEVI时的意外发现。

一、GEVI的优势

       Baker教授先是介绍了GEVI的优势。大脑中神经元众多，且神经细胞的动作电位传递得非常快。传统的电生理的方法是在每个像素点放一个电极，这种方法不仅通量低，且会对神经元造成损伤。之后人们又发展出了对电位敏感的化学分子，不过化学分子的特异性差，不能特异地结合在神经细胞上，因此有很高的背景干扰。而GEVI作为蛋白质，可以同时具有高通量、无损伤和高特异性的优点，因此有很广的应用前景。

二、GEVI的种类

       Baker教授介绍说，GEVI主要分为基于Voltage Sensing Domain(VSD)和基于视紫红质蛋白(rhodopsin)两种类型。

       基于Rhodopsin的GEVI的优点是反应速度快，时间分辨率高，但是rhodopsin蛋白本身荧光量子产率低，需要很强的激光来激发，这限制了这种探针的应用。之后，有人将荧光蛋白和Rhodopsin结合起来，利用eFRET效应解决了量子产率低的问题；但是rhodopsin在光照下会产生光电流，从而会缓慢改变细胞状态，这个缺点目前仍然没有解决。

       基于VSD的GEVI虽然时间分辨率目前没有基于rhodopsin的GEVI高，但是没有光电流，荧光亮度也很高。VSD有四个跨膜区域：S1, S2, S3和带正电荷的S4，在膜两侧电位变化时会有构象改变。这个种类的GEVI目前发展很宽，做出了一系列好的探针，包括ASAP1, ASAP2, Nabi, Arclight, Butterfly和Baker教授新的还未发表的新成果Bongwoori。

三、对比Arclight和Bongwoori

       Baker教授使用和Arclight相似的骨架，对Arclight的linker进行了优化得到Bongwoori，使其时间分辨率大大提高。Baker教授在讲座中从各个角度展示了Bongwoori的特点：既具有Arclight的较高的灵敏度，又解决了Arclight的时间分辨率很低的问题（注：虽然还是没有基于rhodopsin的GEVI的时间分辨率高）。

四、意外的发现——胞内pH的变化

       Baker教授在发展名为Pado的GEVI时发现，随着多次改变细胞的膜电位，荧光亮度的基线在下降。进一步研究发现，通过膜片钳改变细胞膜电位会产生膜电流，从而降低胞内的pH，而pH降低也会降低荧光蛋白的亮度。因此，反复给细胞电压刺激会使荧光强度的基线下降。Baker教授进一步利用这一特点对pH成像，检测神经细胞发生动作电位时的不同区域的pH的变化，发现神经细胞发生动作电位时突触相对于胞体有更大的pH下降。

五、意外的发现——ER的膜电位变化

       Baker教授介绍说，这一发现来得十分意外：他的一个学天文学出身的博士后缺少做膜片钳技术的经验，选择了一个有很多蛋白积聚在内质网的细胞来做电生理测试（一般大家都不会选这样的细胞来测试），从而意外发现全细胞膜片钳改变细胞膜电位的同时会影响内质网的膜电位。（已经通过实验证明了这些蛋白不是积聚在高尔基体中。）

六、对比钙离子探针(GECI)

       钙离子探针的灵敏度更高，但是时间分辨率极低。因此，钙离子探针更适合探测哪些神经元在某一段时间内产生过动作电位，从而了解某一过程涉及哪些神经元。然而，钙离子探针完全无法得知各神经元产生动作电位的次序，也无法探测到神经细胞去极化和超极化的过程；而这些都是GEVI可以做到的。因此，Baker教授认为，人们未来有必要将之前用钙离子探针做过的实验用GEVI再做一遍，从而获得更多的神经信息。

七、对GEVI领域的其他看法

1. 目前发展GEVI的研究者太看重用△F/F（膜电位每变化100mV，荧光强度变化量和荧光强度的比值）来表示的灵敏度，这可能会陷入误区。如果荧光强度(F)太小的话，很小的△F也会产生很大的△F/F。因此△F/F并不是灵敏度的唯一评判标准，荧光强度(F)本身也应作为重要的参量。
2. 对于荧光蛋白来说，二聚体荧光蛋白的信号较强。Baker教授介绍，当他们讲二聚体蛋白突变成单聚体蛋白后，信号强度降低70%.
3. 没有所谓的“最好的”探针，不同探针有不同的用途。