撰稿：李晨阳，审核：陈良怡

2026年7月19日，受北京大学IDG麦戈文脑科学研究所邀请，美国弗吉尼亚大学Ammasi Periasamy教授在北京大学金光生命科学楼邓祐才报告厅作了题为“Two-photon Microscopy to Monitor Metabolic and Oxygen-Tension Responses in Live Animal Models of Alzheimer’s Disease”的学术报告，报告由陈良怡教授主持。

Periasamy教授长期从事荧光寿命成像显微镜（fluorescence lifetime imaging microscopy，FLIM）及其生物医学应用研究。他的团队发展了多种基于荧光寿命的成像和分析方法，用于观察细胞及组织中的代谢状态。本次报告聚焦双光子FLIM和磷光寿命显微镜（phosphorescence lifetime imaging microscopy，PLIM）的最新进展。报告介绍了如何利用NAD(P)H和FAD的内源荧光寿命表征细胞代谢状态，如何结合细胞分割分析细胞间和细胞内的代谢异质性，以及如何同步观察活体脑组织中的代谢变化和氧张力。报告还展示了这些技术在阿尔茨海默病小鼠模型中的应用。

1 FLIM揭示线粒体功能障碍及其疾病关联

报告首先介绍了基于NAD(P)H和FAD荧光寿命的细胞代谢研究方法。NADH、NADPH和FAD是细胞氧化还原反应中的重要辅酶。NADH和NADPH的荧光光谱高度重叠，因此在自发荧光成像中通常合称为NAD(P)H。NAD(P)H和FAD参与三羧酸循环、脂肪酸氧化和电子传递链等过程，其荧光寿命会受到分子游离状态、蛋白结合状态和局部微环境的影响。游离态和蛋白结合态NAD(P)H具有不同的荧光寿命。FAD的游离态和蛋白结合态也表现出不同的寿命特征。因此，FLIM可以在不加入外源荧光标记的条件下，观察细胞代谢状态的相对变化。需要强调的是，FLIM测量的是内源荧光分子的寿命和结合状态，而不是直接测量代谢通量。只有结合药理学干预、生化测定和适当的代谢模型，才能进一步判断细胞是否偏向氧化磷酸化或糖酵解。

报告还介绍了STED-FLIM在线粒体研究中的应用。STED突破了传统光学显微镜的衍射极限。FLIM则提供与荧光强度相对独立的寿命信息。二者结合后，可以在亚细胞乃至细胞器尺度观察代谢相关分子的空间异质性，为研究线粒体结构与功能之间的关系提供新的工具。报告进一步介绍了基于寿命参数构建的荧光寿命氧化还原比值，即fluorescence lifetime redox ratio。传统氧化还原比通常依赖NAD(P)H和FAD的荧光强度，容易受到探针浓度、激发功率、光漂白和光路变化等因素影响。寿命氧化还原比则利用NAD(P)H和FAD的结合态比例或其他寿命参数构建指标，可在一定程度上降低强度波动带来的误差。在确定的细胞类型和实验条件下，NAD(P)H与FAD寿命参数的组合可以灵敏反映药物刺激和疾病状态引起的代谢变化。该方法已被用于分析肿瘤细胞对化疗药物的反应，也可用于研究神经退行性疾病中的代谢异常。

图1 基于FLIM检测多柔比星处理后前列腺癌细胞NAD(P)H代谢状态变化（Shagufta Rehman Alam et al., 2017）[1]

报告随后介绍了基于细胞分割和局部感兴趣区域（region of interest，ROI）的单细胞FLIM分析方法。传统FLIM分析常使用整细胞的平均寿命或平均氧化还原比。这种处理简单，但会掩盖细胞内部的空间差异，也会忽略细胞群体中不同亚群的代谢状态。基于图像分割的分析方法先识别单个细胞，再从每个细胞中提取NAD(P)H、FAD和色氨酸等内源荧光分子的寿命参数。进一步设置局部ROI后，还可以比较线粒体富集区域与细胞质区域的寿命差异。这些局部参数可分别作为线粒体氧化代谢和细胞质代谢状态的近似表征。它们不能完全替代直接的代谢通量测定，但可以揭示传统整细胞平均分析难以识别的空间异质性。在药物处理或代谢干预实验中，该方法还可以识别响应不同的细胞亚群，从而提高对肿瘤细胞代谢重编程和治疗反应的分析精度。

图2 ROI-based单细胞FLIM分析流程用于细胞代谢状态定量评价（Horst Wallrabe et al., 2018）[2]

2 双光子FLIM与光声显微成像解析阿尔茨海默病中的线粒体功能障碍

报告进一步介绍了双光子FLIM和光声显微成像（photoacoustic microscopy，PAM）在活体脑研究中的应用。双光子FLIM使用近红外脉冲光激发组织中的荧光分子。与单光子激发相比，双光子激发具有较好的光学层析能力，并可减少焦平面以外的光漂白和光损伤。它适合在活体组织中观察NAD(P)H等内源荧光分子的寿命变化。光声显微成像则使用光激发组织中的吸收分子，并通过超声探测由热弹性膨胀产生的声信号。血红蛋白是脑组织中重要的内源吸收体。通过选择不同的激发波长，光声成像可以观察血管结构、血红蛋白浓度和血氧饱和度等参数。双光子FLIM主要提供细胞代谢和分子微环境信息。光声显微成像主要提供血管和组织氧合信息。两种技术相互补充，可以从细胞代谢、氧供应和血管功能等不同层面研究活体脑组织的能量代谢。

在此基础上，报告讨论了线粒体功能障碍与阿尔茨海默病之间的关系。线粒体是细胞能量转换和氧化还原调控的核心细胞器。越来越多的研究表明，线粒体功能异常可能在阿尔茨海默病的早期阶段出现，并参与后续的神经元功能损伤。报告介绍了一条由溶酶体通向线粒体的营养感知通路。营养信号激活溶酶体表面的mTORC1后，可促进线粒体活性和线粒体DNA合成。淀粉样蛋白β寡聚体则会干扰这一过程，削弱营养信号诱导的线粒体激活。这一结果提示，Aβ寡聚体不仅可能直接损伤突触和细胞膜，也可能破坏神经元内部的细胞器通信，使线粒体无法对营养状态作出正常反应。FLIM能够动态观察NAD(P)H等代谢辅酶的寿命变化，因此可用于分析这一过程所伴随的细胞代谢改变。将FLIM与血氧和血管成像结合后，还可以进一步判断细胞代谢异常是否同时伴有氧供应或氧利用障碍。

图3 多光子光声显微成像揭示mTORC1介导的线粒体氧代谢调控（Andrés Norambuena et al., 2018）[3]

3 FLIM/PLIM联合成像研究代谢与氧张力调控

报告的第三部分介绍了磷光寿命显微镜及其在组织氧测量中的应用。FLIM通常测量纳秒尺度的荧光衰减。PLIM则测量微秒甚至更长时间尺度的磷光衰减。许多磷光探针的激发态会被分子氧猝灭，因此其磷光寿命随氧浓度变化。在经过探针标定并控制温度、pH和局部环境等因素后，可以根据磷光寿命估算组织中的氧浓度或氧张力。一般而言，氧浓度越高，磷光猝灭越强，磷光寿命越短；氧浓度降低时，磷光寿命则会延长。与单纯依赖发光强度的氧探针相比，寿命测量对探针浓度和激发光强变化相对不敏感。因此，PLIM适合用于活体组织中的动态氧测量。报告展示了双光子FLIM与PLIM联合成像的策略。FLIM通过检测NAD(P)H等分子的寿命变化，表征细胞代谢状态。PLIM则用于测量局部氧张力。二者结合后，可以同时分析细胞代谢活动与氧供应之间的关系。

报告还重点介绍了使用单一激发波长采集多种代谢信号的方法，使用约800 nm的双光子激发，并通过不同的发射通道和寿命特征区分NAD(P)H与FAD信号。与依次改变激发波长并顺序采集相比，该方法缩短了不同代谢通道之间的时间间隔，也减少了活体组织运动造成的通道错位。结合细胞分割和自动化分析后，该策略可在单细胞尺度提取多种寿命参数，并比较不同细胞及不同脑区的代谢反应。在阿尔茨海默病小鼠模型中，报告展示了磷光寿命延长和局部氧张力下降的现象。这提示病理脑组织可能同时存在氧供应不足、氧利用异常或二者的共同作用。

FLIM和PLIM提供的是两个不同但相互关联的测量维度。FLIM反映细胞内代谢辅酶的状态。PLIM反映细胞周围的氧环境。二者联合后，可以更直接地研究“氧是否到达组织”“细胞是否利用氧”以及“代谢反应是否与氧供应匹配”等问题。

图4 微秒级FLIM（PLIM）原理，资料来源：Becker & Hickl[4]

总结

本次报告展示了荧光寿命成像从细胞培养系统走向活体脑组织研究的发展路径。首先，NAD(P)H和FAD的内源荧光寿命为研究细胞代谢提供了无标记窗口。FLIM不直接测量代谢通量，但可以在适当的实验设计和生化验证支持下，灵敏表征代谢状态及其空间异质性。其次，细胞分割、局部ROI和自动化分析将FLIM从整幅图像的平均测量推进到单细胞和亚细胞分析。研究者因此可以识别不同细胞亚群，并观察线粒体富集区域与细胞质区域之间的代谢差异。第三，双光子FLIM、PLIM和光声显微成像提供了互补信息。FLIM观察细胞内代谢状态。PLIM测量局部氧张力。光声显微成像则观察血管结构和组织氧合。多模态联合成像使研究者能够同时分析氧供应、氧利用和细胞代谢。最后，阿尔茨海默病模型中的研究说明，神经退行性疾病并不只是蛋白聚集或神经元死亡的问题。Aβ寡聚体还可能破坏溶酶体与线粒体之间的信号传递，降低线粒体对营养信号的响应，并造成脑组织代谢和氧利用失衡。

这些工作表明，寿命成像的价值不仅在于获得一幅代谢“图像”，更在于建立可重复、可定量的功能测量。未来若能进一步结合血流测量、代谢通量分析、神经活动记录和纵向疾病观察，FLIM与PLIM有望成为研究脑代谢失衡及其疾病机制的重要工具。

参考文献

1. Alam, S.R., Wallrabe, H., Svindrych, Z. et al. Investigation of Mitochondrial Metabolic Response to Doxorubicin in Prostate Cancer Cells: An NADH, FAD and Tryptophan FLIM Assay. Sci Rep 7, 10451 (2017). https://doi.org/10.1038/s41598-017-10856-3

2. Wallrabe, H., Svindrych, Z., Alam, S.R. et al. Segmented cell analyses to measure redox states of autofluorescent NAD(P)H, FAD & Trp in cancer cells by FLIM. Sci Rep 8, 79 (2018). https://doi.org/10.1038/s41598-017-18634-x

3. Norambuena, A., Wallrabe, H., Cao, R. et al. A novel lysosome‐to‐mitochondria signaling pathway disrupted by amyloid‐β oligomers. EMBO J 37, EMBJ2018100241 (2018). https://doi.org/10.15252/embj.2018100241

4. https://www.becker-hickl.com/literature/application-notes/combined-fluorescence-and-phosphorescence-lifetime-imaging-flim-plim-with-the-zeiss-lsm-710-nlo-microscopes/