陈良怡课题组在Science China Life Sciences在线发表文章
“钙灯笼”超分辨成像发现线粒体对ER钙库释放顺序的决定作用
荧光显微成像技术的广泛应用奠定了现代生命科学的基础，实现了对细胞精细结构的观察。然而，空间分辨率上的提升往往需要对更多的光子数进行检测，这就不可避免地限制了大部分的超高分辨荧光显微镜的时间分辨率，丢失了反应细胞功能的动态信息。目前仍没能找到一种有效的手段实现细胞结构和功能的同时观察。
针对这个难题，北京大学分子医学研究所、IDG/麦戈文脑科学研究所陈良怡课题组发展了一种新的超分辨荧光成像手段，通过荧光标记胞浆中的钙离子同时以“暗影”的形式“反向”标记出线粒体和溶酶体等细胞器，揭示了线粒体对内质网（ER）钙库释放顺序的决定作用，并阐明背后机制。该研究论文在线发表于Science China Life Sciences，题为Mitochondria determine the sequential propagation of the calcium macrodomains revealed by the super-resolution calcium lantern imaging。值得注意的是，该方法被证明同样适用于研究细胞器结构与胞内其他重要的第二信使如cAMP的区域化激活的相互关系。
图1 “钙灯笼”超分辨成像
该成像策略通过在COS-7细胞中表达遗传表达的绿色荧光蛋白GCaMP6s（一种常用的胞浆Ca2+指示剂），外加ATP刺激使胞内Ca2+浓度升高，大量的GCaMP6s蛋白结合了大量的Ca2+发出荧光，从而实现在很短时间内获得足够多的光子数。同时结合转盘式结构光照明显微镜（SD-SIM）特有的在Z轴方向上的聚焦成像的优势, 如线粒体和溶酶体等未被GCaMP6s标记的细胞器则会以暗影形式被捕获，且根据形状、运动特点的不同进行区分。该过程就像点燃了一盏钙离子的灯笼照亮钙信号在细胞内传播过程（图1）的同时，又窥探到不同细胞器的分布以及动态相互作用，故称之为“钙灯笼”超分辨成像（图2）。
图2 “钙灯笼”成像标记线粒体和溶酶体
运用此方法，研究人员发现，ER钙库的最先释放的区域往往可以看到线粒体的高度富集（图1）。为验证二者的关系，该研究又同时标记了ER中的Ca2+，通过antimycin A破坏线粒体结构和功能，在有无外钙等条件下进行多次ATP刺激实验。实验结果阐述了线粒体对不同来源的钙信号存在不同调控作用：一方面线粒体会在整体水平上加强外钙内流的效应，另一方面，线粒体促进临近ER钙库的填充且该作用与线粒体的密度呈正相关。
因此，与ER是一个均质的、联通的腔膜系统的传统概念不同，该研究认为ER中的钙离子浓度分布是不均匀的，也就是存在异质性的特点，其中线粒体越密集的区域Ca2+水平越高，因而受刺激时最先释放（图3左）。然而，当破坏线粒体且发生ER钙库重填充之后，其优先释放位置则由ATP刺激位置决定的（图3中/右），猜测是因为ER钙浓度变均匀了，加药位置优先产生了大量的IP3分子作用于ER上的受体，刺激该区域钙的释放。
图3 ATP刺激位置与ER钙释放顺序的关系
该研究获得北京自然科学基金(L172003, 7182063)，国家自然科学基金(81925022, 91854112, 31327901, 31521062, 31570839, 91750203),以及国家科技重大专项计划(2016YFA0500400)资助。