邹鹏课题组报道基于荧光成像的蛋白质定向进化方法

  2023年7月27日，北京大学化学与分子工程学院、合成与功能生物分子中心、IDG麦戈文脑科学研究所、北大-清华生命科学联合中心邹鹏课题组，在《Cell Reports Methods》发表题为“Functional imaging-guided cell selection for evolving genetically encoded fluorescent indicators”的研究论文，报道了基于荧光成像的定向进化方法Faculae，可在哺乳动物细胞中高效稳定构建突变体文库，在显微镜下针对混合细胞文库中的优势表型细胞进行快速光激活选择。该方法实现了遗传编码远红色钙探针的多维度表型筛选与定向进化。

　　荧光探针定向进化的难点在于需要考虑多种荧光表型参数，包括荧光强度和动态响应幅度等，无法直接通过流式分选方法进行筛选，而常用的多孔板阵列文库成像筛选存在通量较低(~103)的局限性，因此研究者认为可以开发一种基于荧光成像的混合细胞文库鉴定、选择方法，在保留多筛选维度的同时提高筛选通量、扩大蛋白质序列的搜索空间。

　　图1 Faculae方法流程示意图

　　在Faculae方法中，研究者使用基于重组酶的细胞“停机坪”(cell landing pad)方法实现高效稳定的哺乳动物细胞文库构建，通过聚焦照明实现单细胞分辨的胞内光敏荧光分子激活，“点亮”具有优势表型的目标细胞，进而通过流式分选回收得到突变体基因型。该技术的特点在于可以利用荧光成像评估细胞内荧光信号的动态变化信息和亚细胞定位信息，单次实验的细胞鉴定数量为104到105，而单个目标细胞激活仅需1-2秒。利用Faculae方法，研究者对远红色钙探针的亮度与动态响应两个指标同时开展评估，从中选择优势突变体，并通过迭代进化成功获得灵敏度提升的Nier1探针。

　　图2 通过Faculae筛选得到的远红色钙探针Nier1s和Nier1b在神经细胞中分别具有更高响应和更高亮度

　　由于Faculae方法能够在哺乳动物细胞中高效构建突变体文库，并在显微镜下鉴定细胞表型并快速选择细胞，该方法为进化荧光探针、化学遗传学元件和光遗传学元件等蛋白质工具提供了新思路。与此同时，该方法也提供了一种在显微镜下简单、快速选择多个目标细胞的新策略，已成功应用于纯化多能干细胞向心肌细胞分化过程中的中间态细胞（Yang, X., Chen, D., Sun, Q. et al. A live-cell image-based machine learning strategy for reducing variability in PSC differentiation systems. Cell Discov 9, 53 (2023).）。

　　北京大学化学与分子工程学院博士生林畅为该论文第一作者，邹鹏研究员为论文通讯作者。该工作得到了北大-清华生命科学联合中心、科技部、国家自然科学基金委的资助。

　　原文链接：

　　https://www.cell.com/cell-reports-methods/fulltext/S2667-2375(23)00181-9